離體蛙心灌流 
 一、【目的要求】   1、學(xué)習(xí)斯氏離體蛙心灌流法; 2、了解心肌的生理特性;   3、觀察Na+,K+,Ca2+及腎上腺素(Adr),乙酰膽堿(ACh)等對離體心臟活動的影響。  
 二、【原理】        將離體蛙心（失去神經(jīng)支配的蛙心）保持在適宜的環(huán)境中，在一定的時(shí)間內(nèi)仍然能夠保持節(jié)律性收縮，心臟正常的節(jié)律性活動需要一個(gè)適宜的理化環(huán)境，離體心臟也是如此，離體心臟脫離了機(jī)體的神經(jīng)支配和全身體液因素的直接影響，可以通過改變灌流液的某些成分，觀察其對心臟活動的作用。心肌細(xì)胞的自律性、興奮性、傳導(dǎo)性及收縮性，都與鈉、鉀及鈣等離子有關(guān)。血鉀濃度過高時(shí)（高于7.9mmol/L），心臟興奮性、自律性、傳導(dǎo)性及收縮性都下降，表現(xiàn)為收縮力減弱、心動過緩和傳導(dǎo)阻滯，嚴(yán)重時(shí)心臟可停搏于舒張期。血鈣濃度升高時(shí)，心臟收縮力增強(qiáng)，過高可使心室停搏于收縮期。血鈣濃度降低，心肌收縮力減弱。血中鈉離子濃度的輕微變化，對心肌影響不明顯，只有發(fā)生明顯變化時(shí)，才會影響心肌的生理特性。腎上腺素可使心率加快、傳導(dǎo)加快及心肌收縮力增強(qiáng)，乙酰膽堿則與腎上腺素的作用相反。  
三、【實(shí)驗(yàn)儀器】   青蛙、 常用手術(shù)器械、蛙板(或蠟盤)、蛙心夾、計(jì)算機(jī)采集系統(tǒng)、張力傳感器、支架、雙凹夾、雙針形露絲刺激電極、滴管、培養(yǎng)皿(或小燒杯)、紗布、棉線、橡皮泥、任氏液。蛙心套管(斯氏套管或八木氏套管)、套管夾、0．65％NaCl、5％NaCI、2％CaCl2、1％KCl、1：5 000腎上腺素、1：10 000乙酰肌堿、300U／mL肝素。   
    四、【方法與步驟】  1、斯氏蛙心插管法   （1）一只青蛙，雙毀髓后背位置于蠟盤中，按前面的方法暴露心臟。仔細(xì)識別心臟周圍的大血管(見右圖)。在左主動脈下方穿一線，于動脈圓錐處結(jié)扎(動物個(gè)體小時(shí)，結(jié)扎位置可靠上些)。再從左右兩主動脈下方穿一線，并打一活結(jié)備用。左手提起主動脈上的結(jié)扎線，右手用眼科剪在結(jié)扎線下方、沿向心方向?qū)用}上壁剪一斜口。選擇大小適宜的蛙心套管，然后將盛有少量(套管內(nèi)2～3 cm高度)任氏液(內(nèi)加入一滴肝素溶液)的斯氏蛙心套管，山開口處插入動脈圓錐(見右圖)。當(dāng)套管到達(dá)動脈圓錐基部時(shí)，應(yīng)將套管稍稍后退，使向動脈圓錐的背部后下方及心尖方向推進(jìn)，經(jīng)主動脈瓣插入心室腔內(nèi)(于心室收縮時(shí)插入，但不可插得過深，以免心室壁堵住套管下口)。此時(shí)可見套管中血液沖人套管，并使液面隨心臟搏動而亡下移動，表明操作成功(否則需退回并重新插入)。用滴管吸去套管中的血液，更換新鮮任氏液。穩(wěn)定住套管后，輕輕提起備用線，將左、右主動脈連同插入的套管用雙結(jié)扎緊(不得漏液)，再將結(jié)線固定在套管的小玻璃鉤上，然后剪斷結(jié)扎線上方的血管。輕輕提起套管和心臟，看清靜脈竇的位置，于靜脈竇下方剪斷有牽連的組織，僅保留靜脈竇與心臟的，使心臟離體(切勿損傷靜脈竇)。用任氏液反復(fù)沖洗心室內(nèi)余血，使套管內(nèi)灌流液不再有殘留血液。保持套管內(nèi)液面高度一致(1.5～2 cm)，即可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。   （2）將插好離體心臟的套管固定在支架上，用蛙心夾夾住少許心尖部肌肉 (不可夾得過多，以免因夾破心室而漏液)。再將蛙心夾上的系線繞過一個(gè)滑輪與張力傳感器相連（如右圖）。注意：勿使灌流液滴到傳感器上。調(diào)節(jié)顯示器上心臟收縮曲線的幅度適中。  
2、 實(shí)驗(yàn)觀察   (1)記錄正常心搏曲線   (2)改用0．65％NaCI溶液灌流，并作好加藥標(biāo)記，觀察心搏變化。待曲線 氏插管裝置出現(xiàn)明顯變化時(shí)，立即吸去套管中的灌流液，同時(shí)做好沖洗標(biāo)記，并用新鮮任氏液清洗2—3次，待心搏恢復(fù)正常。注意：換液時(shí)切勿碰套管，以免影響描記曲線的基線，同時(shí)保持灌流液面一致(以下同)。 觀察可得，NaCI溶液會阻遏心臟搏動。   (3) 迅速用新鮮任氏液清洗2～3次，待心搏恢復(fù)正常。向套管內(nèi)加入1～3滴2％CaCI：溶液，觀察并記錄心搏曲線的變化。當(dāng)出現(xiàn)明顯變化時(shí)，立即更換任氏液，待心搏恢復(fù)正常(如果恢復(fù)遲緩，可多次沖洗)。   (4)同法向套管中加1—2滴1％KCl溶液，記錄心搏曲線的變化。當(dāng)心搏曲線變化時(shí)，同法更換灌流液，待心搏恢復(fù)正常。   (5)同法記錄套管中加入l～2滴的腎上腺素溶液(1：10 000)后心搏曲線的變化。  (6)同法記錄套管中加入1—2滴乙酰膽堿溶液(1：10 000)后心搏曲線的變化。
分析：滴加Na離子溶液后，心跳減弱，這種現(xiàn)象出現(xiàn)的原因是由于灌注液中缺乏Ca2+，當(dāng)Na＋明顯增高時(shí)，膜內(nèi)外鈉離子的濃度梯度增大，因此，細(xì)胞Na離子內(nèi)流加快，去極速
度和幅度均增加，導(dǎo)致傳導(dǎo)性和自律性增高。同時(shí)，Na離子內(nèi)流的增多促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)Ca2＋
的
外運(yùn)使細(xì)胞內(nèi)Ca2＋
濃度降低，因此，心肌收縮能力減弱。 
 
3、 滴加2%CaCl溶液 分析：細(xì)胞外Ca2＋在細(xì)胞膜上對Na＋內(nèi)流有競爭性抑制作用，稱為膜屏障作用。[Ca2＋]  增高時(shí)，Na＋內(nèi)流受抑制，細(xì)胞0期除極速度與幅度減小，使興奮性及傳導(dǎo)性均降低。[Ca2 ＋] 增高使Ca2＋內(nèi)流增多，因此慢反應(yīng)細(xì)胞0期去極化加快加強(qiáng)，傳導(dǎo)性增高，而快反應(yīng)細(xì)胞平臺期縮短，有效不應(yīng)期縮短，復(fù)極加速。Ca2＋內(nèi)流增多，使心肌收縮能力增強(qiáng)。[Ca2＋ ] 降低時(shí)，所引起的變化與高鈣時(shí)相反。因此加入CaCl2后，心率減少、振幅減少，基線上移。
4、滴加1%KCl溶液分析：滴加1％KCl后的心搏曲線，曲線的頻率逐漸減小，愈來愈疏，幅度逐漸下降，zui后停止在基線處，即心臟停博于舒張狀態(tài)。因?yàn)楫?dāng)細(xì)胞K+濃度增高時(shí)，K+與Ca2+有競爭性拮抗作用，K+抑制細(xì)胞膜對Ca2+的轉(zhuǎn)運(yùn)，使進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)Ca2+減少，心肌的興奮—收縮偶聯(lián)過程減弱，心肌收縮力降低。所以心搏曲線振幅減小。 
5、 滴加1：10000腎上腺素溶液分析：滴加腎上腺素后，蛙心收縮增強(qiáng)，心臟舒張*，描記的心搏曲線幅度明顯增大。其作用機(jī)理是，腎上腺素可與心肌細(xì)胞膜上的B受體結(jié)合，提高心肌細(xì)胞和肌漿網(wǎng)膜Ca2+通透性，導(dǎo)致肌漿中Ca2+濃度增高，使心肌收縮增強(qiáng)。另外，腎上腺素還有降低肌鈣蛋白與Ca2+親和力，促使肌鈣蛋白對Ca2+的釋放速率增加，提高肌漿網(wǎng)膜攝取Ca2+的速度，刺激Na+與Ca2+交換，使復(fù)極期向細(xì)胞外排出Ca2+的作用加速，這樣，將使心肌舒張速度增快，整個(gè)舒張過程明顯增強(qiáng)。  
 6、 滴加1：10000乙酰膽堿溶液分析：上圖可示，蛙心收縮減弱，心率減慢，zui后出現(xiàn)蛙心停止舒張階段。其機(jī)理為：乙酰膽堿與心肌細(xì)胞膜M受體結(jié)合，一方面提高心肌細(xì)胞膜K+通道的通透性，促使K+外流，將引起：1）竇房強(qiáng)細(xì)胞復(fù)極時(shí)K+外流增多，zui大復(fù)極電位值增大；Ik衰減過程減弱，自動除極速度減慢。這兩方面因素導(dǎo)致竇房自律性降低，心率減慢。2）復(fù)極過程中K+外流增加，動作電位2、3期縮短，Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)減少，使心肌收縮減弱；另一方面乙酰膽堿可直接抑制Ca2+通道，減少Ca2+內(nèi)流，進(jìn)而使心肌收縮減弱。